Увидеть своими глазами работу генов в целом, неразрезанном мозге почти невозможно. Тем удивительнее разработка российских физиологов, которые смогли сделать мозг прозрачным. Более того, они смогли проследить за работой нужных белков, не повреждая мозговую ткань.
Человеческий мозг остается самой сложной биологической структурой для понимания законов его работы. В конце концов, человек может познать мозг лишь с помощью другого, своего собственного мозга, хоть и привлекая в помощь современные технологии. Еще не так давно мозг можно было сравнить с «черным ящиком», но сейчас он постепенно «светлеет».
Сегодня в арсенале ученых имеется много методов для исследования работы мозга. Все они обладают теми или иными ограничениями. Функциональная томография анализирует целый мозг и позволяет увидеть, как вовлечены его части в решение какой-либо задачи. Это макроуровень. Регистрация электрической активности отдельных нейронов позволяет изучать мозг на клеточном уровне. Наконец, проникнуть в молекулярные процессы мозга можно при помощи микроскопических методов. Однако для этого мозг надо разъять на ультратонкие срезы и исследовать фрагменты ткани.
Союз лазера и микроскопа
Но увидеть, как работает целый мозг в процессе обучения и формирования памяти на молекулярном уровне, также возможно. Для этого надо объединить томографический и микроскопический методы. Именно это делает ультрамикроскопическая оптическая томография.
«Сама идея ультрамикроскопии возникла еще в начале прошлого века, -- рассказал корреспонденту Infox.ru член-корреспондент РАН, руководитель отдела системогенеза НИИ нормальной физиологии РАМН Константин Анохин. – В 1901 году немецкие ученые изобрели метод, с помощью которого они исследовали оптически прозрачный образец с помощью плоского пучка света».
В наше время, когда появился лазер, этот подход развивали две группы немецких ученых, причем один метод был применим только к микрообъектам, а другой – разработанный под руководством Ульриха Додта -- годился и для макрообъектов. Именно его взяли за основу российские ученые при создании своей оригинальной установки для ультрамикроскопической оптической томографии.
Основные части установки, которая создана под руководством Константина Анохина в сотрудничестве с Институтом прикладной физики в Нижнем Новгороде, – это лазер с длиной волны до 488 нм, флуоресцентный микроскоп, устройство перемещения образца и видеокамера. «Наша установка оказалась по многим параметрам лучше, чем немецкая, -- рассказал корреспонденту Infox.ru кандидат биологических наук Александр Лазуткин. – Она обладает большим полем зрения и более высоким разрешением, что позволяет исследовать крупные образцы мозга на клеточном уровне без необходимости смены объектива. Использование волоконной оптики сделало нашу систему более компактной, универсальной и надежной в работе».
Как сделать «черный ящик» прозрачным
Чтобы мозг можно было исследовать таким образом, его надо сделать прозрачным. Буквально, как стекло. Для этого существуют специальные методы. Главное – избавиться от воды, лишних белков и липидов. Если такой «просветленный» мозг мыши поместить в специальный раствор с соответствующим коэффициентом преломления, через него можно даже читать, в чем на собственном опыте убедились корреспонденты Infox.ru.
Ольга Ефимова и другие сотрудники НИИ нормальной физиологии достигли больших успехов в методах просветления ткани: они разработали несколько различных растворов, один из которых сейчас патентуют.
За работой мозга можно подсмотреть через работу генов
Сделать мозг прозрачным – это еще полдела. Надо в прозрачном мозге увидеть интересующие нас белки, а для этого их пометить. Есть два способа. Первый -- покрасить белки флуоресцентными красителями, предварительно связанными с антителами. Подходящие для данного метода способы окраски разрабатывал Александр Лазуткин. Биологи добились того, чтобы можно было метить белки не только на срезах, как делали до сих пор, а в объемной ткани. И хотя прокрасить таким образом целый мозг взрослой мыши не получилось, но удалось сделать это с отдельными структурами мозга или с целым мозгом детенышей.
Второй способ – использовать трансгенных животных, у которых ген интересующего нас белка связан с геном зеленого флуоресцирующего белка (GFP), так что клетки, в которых синтезируется данный белок, в синем излучении светятся зеленым светом. Таким способом можно получить целый светящийся мозг взрослой мыши.
Цель всего этого – увидеть, какие клетки мозга принимают участие в процессе обучения и памяти. Это удается благодаря работе специфических генов. В 1987 году Константин Анохин открыл группу генов (их называют ранними генами, наиболее известный представитель этой группы – ген c-fos), которые экспрессируются в мозге при любом обучении, при любом восприятии новой информации. Эти гены запускают работу других генов, для того чтобы в нейронах и синапсах произошли перестройки, необходимые для формирования памяти.
Экспрессия генов означает, что в мозге синтезируются соответствующие белки. Именно эти белки, помеченные флуоресцентной меткой, и становятся видимыми в микроскоп.
Оптические срезы создают образ целого
Луч лазера, проходя через специальную диафрагму и фокусирующую линзу, становится плоским. Он оптически разрезает ткань мозга подобно тому, как нож в микротоме режет ткань на ультратонкие срезы. Камера снимает срезы с заданным шагом, например 10 микрон, а затем программа собирает эти виртуальные оптические срезы в виртуальное трехмерное изображение целого мозга.
На мониторе вращается мозг двухдневной мыши, которая столкнулась с новым для себя запахом. В ее мозге немедленно активизировался один из ранних генов, и продукт экспрессии этого гена мы наблюдаем в окрашенных ярко-зеленым цветом клетках мозга.
Но чаще ученые исследуют работу генов не в целом мозге, а в его частях, например, в гиппокампе. Это очень важная структура для формирования памяти, и именно в нем при обучении активно работают ранние гены.
«Вот в этом гиппокампе мыши, которую обучали в задаче условнорефлекторного замирания, -- объяснил Infox.ru аспирант НИИ нормальной физиологии РАМН Сергей Чехов, -- экспрессируется ген c-fos. Мы можем не только увидеть клетки, в которых работал этот ген, но и посчитать их. Для этого гиппокамп виртуально делят на зоны и раскрашивают зоны в разные цвета».
Просветлять, чтобы изучать
Просветлять и просвечивать можно не только мозг, но и другие органы и ткани. На мониторе вращаются прозрачное сердце, легкие мыши, прозрачный мышиный эмбрион. Свечение в них происходит за счет естественной флуоресценции белков. На изображениях видна тончайшая анатомическая структура органов. Метод, говорят ученые, может быть очень полезен в экспериментальной медицине, так как даст возможность увидеть все нарушения, вызванные каким-либо воздействием. А прозрачный мышиный эмбрион дает наглядное представление о процессах развития органов и тканей.
Можно просветлить и ткани человека. Конечно, не целые органы, но кусочек ткани размером 15 на 15 мм – вполне. Только вот ткань легких курильщика не просветляется, говорят ученые.
Наконец, просветлению поддается раковая опухоль. На мониторе корреспонденты Infox.ru наблюдают, как становится видна ее внутренняя система сосудов. В опухоли можно отследить и работу отдельных генов, если ее ткань перед тем прокрасить с помощью специфических антител.
А в будущем биологи собираются проследить, как работают в мозге лекарственные вещества: как они действуют на молекулы-мишени и какие изменения вызывают.
